Keul-o-test

Mycoplasma UU-MH

Auf Trockennährmedium basierender Assay für den qualitativen Nachweis, die indikative Keimzahlbestimmung sowie die Antibiotikaresistenzbestimmung von UU (Ureaplasma urealyticum) und MH (Mycoplasma hominis) im humanen Urogenitaltrakt.

Einleitung
Bei Mycoplasma handelt es sich um den Haupterreger von nichtgonorrhoischer Urethritis (NGU), Zervizitis, Pelvitis, Orchitis, Epididymitis etc. sowie um eine mögliche Ursache für Infertilität bei Frauen und Männern¹. Dieses Pathogen kann die Epithelzellen des Urogenitaltrakts angreifen und zerstören und als ein Kofaktor bei der Infektion mit sexuell übertragbaren Krankheiten  (HIV) sowie einer Progression dieser Krankheiten wirken. Mycoplasma-Erreger (hierbei vor allem UU und MH) können klinisch relevante Geschlechtskrankheiten verursachen. Das Auftreten von Mycoplasma- oder Ureaplasma-Infektionen erfolgt mit zunehmender Häufigkeit; durch die missbräuchliche Verwendung antibiotischer Wirkstoffe kommt es dabei zu immer gravierenderen Antibiotikaresistenzen und zu einer ernsthaften gesundheitliche Bedrohung². Die Grundvoraussetzung bei der Behandlung und Eindämmung von Mycoplasma-Infektionen ist die rechtzeitige und genaue Diagnose der Infektion. Derzeit stellt die Anzucht von Mycoplasma eine zuverlässige Methode für die Diagnose von Mycoplasma-Infektionen dar.

Messprinzip
Das Mycoplasma-Kit basiert auf der Kultivierung des Erregers sowie auf dem Nachweis biochemischer Reaktionen. Die Herstellung des Mediums erfolgt durch Mischen von Lyophilisat und Verdünnungsmittel. Bei Vorliegen von UU in der Probe wird der im Medium vorliegende Harnstoff nach der Anzucht des Erregers durch Urease abgebaut und es kommt zur Freisetzung von NH₃³; bei Vorliegen von MH erfolgt die Freisetzung von NH₃ durch den Arginase-vermittelten Abbau von Arginin. Die Freisetzung von NH₃ bewirkt einen Anstieg des pH-Werts des Flüssigmediums; die Ergebnisauswertung erfolgt anhand eines Farbumschlags des Farbindikators. Eine Testplatte enthält 12 Antibiotika in jeweils zwei unterschiedlichen Konzentrationen. Das Vorliegen einer Antibiotikaresistenz des Erregers hat die Inhibition der enzymatischen Aktivität und somit ein Ausbleiben des Farbumschlags zur Folge.

Komponenten

1. Testplatten 
   Testplatten mit jeweils 30 Näpfen. Die Beschichtungen der Näpfe sind nachfolgend aufgeführt: UU/Linomycin; MH/Erythrocin; UU≥10⁴/Lincomycin und Inhibitor; MH≥10⁴/Erythrocin und Inhibitor; MIN/Minocyclin mit 2/8 mg/l; DOX/Doxycyclin mit 4/8 mg/l; ERY/Erythromycin mit 2/8 mg/l; AZI/Azithromycin mit 1/4 mg/l; JOS/Josamycin mit 2/8 mg/l; THI/Thiamphenicol mit 2/8 mg/l; CLI/Clindamycin mit 1/4 mg/l; CLA/Clarithromycin mit 1/4 mg/l; ROX/Roxithromycinat mit 1/4 mg/l; SPA/Sparfloxacin mit 1/4 mg/l; LEV/Levofloxacin mit 1/4 mg/l; GAT/Gatifloxacin mit 1/4 mg/l.
2. Lyophilisat 
   Fläschchen mit jeweils 1,2 ml Rinderpepton und Rinderherzinfusion.
3. Verdünnungsmittel 
   Fläschchen mit jeweils 4 ml Flüssigkeit zum Lösen des Lyophilisats. Nach dem Mischen von Verdünnungsmittel und Lyophilisat setzt sich das Medium zusammen wie nachfolgend beschrieben. Pro 1000 ml destilliertes Wasser: 7,27 g Rinderpepton, 2,51 g Hefeextrakt, 6,55 g Rinderherzinfusion, 1,45 g Harnstoff, 1,45 g Argininhydrochlorid, 7,9 g Salzmischung, 182 ml Pferdeserum, 0,03 g Phenolrot, 9,2 ml Wachstumsfaktormischung und 9,2 ml Antibiotikamischung. Der pH beträgt 6.3±0.3.
4. Mineralöl 
   Fläschchen mit 28 ml Paraffinöl.
5. Gebrauchsanleitung
6. Bögen Ergebnispapier
7. Pipettenspitzen

Zusätzlich benötigtes Material

1. Probenahme-Tupfer
2. Inkubator für bakteriologische Untersuchungen (36°C,37°C,38°C)

Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen

1. Ausschließlich für den professionellen Gebrauch.
2. Befolgen Sie die Gebrauchsanleitung sorgfältig. Weicht die Handhabung des Produkts von den Anweisungen in der Gebrauchsanleitung ab, kann eine Zuverlässigkeit der Testergebnisse nicht gewährleistet werden.
3. Für sämtliche potentiellen chemischen Risiken siehe das Datensicherheitsblatt sowie die Produktkennzeichnung.
4. Tragen Sie bei der Handhabung von Proben und Reagenzien Einweghandschuhe. Waschen Sie sich nach Beendigung der Arbeiten die Hände.
5. Verwenden Sie den vorliegenden Assay ausschließlich in einer geeigneter Arbeitsumgebung. Vermeiden Sie den Gebrauch des Assays in einer Arbeitsumgebung mit Säure- oder Laugedämpfen, flüchtigem Gas etc..
6. Das Wachstum von Mycoplasma in Kulturbrühe führt nicht zu einer Trübung des Mediums. Der vorliegende Assay verfügt über eine einzigartige Methode, das Wachstum nicht relevanter Bakterien effektiv zu hemmen. Tritt im rekonstituierten Medium eine Trübung auf und verfärbt sich das Medium rot, zeigt dies kein positives Ergebnis an.
7. Das rekonstituierte Medium wird zusammen mit den hinzugefügten Proben in die einzelnen Näpfe zur Testung der Antibitiokaresistenz gegeben. Färbt sich das rekonstituierte Medium in allen Näpfen mit Ausnahme des C-Napfs (Kontrolle) dunkler oder hellrot, liegt dies möglicherweise an einer abweichenden Alkalität der Patientenproben unter pathologischen Bedingungen. Es wird in diesem Fall empfohlen, die Sekretprobe des Patienten erneut zu testen.
8. Bei Untersuchung der Antibiotikaresistenz positiver, in normalem Wachstumsmedium validierter Proben: Pipettieren Sie 50 μl der kultivierten positiven Probe in das rekonstituierte Medium des vorliegenden Kits und befolgen Sie die nachfolgend beschriebenen Arbeitsanweisungen. Wechselt die Farbe im Fläschchen nach rot, muss die Mycoplasma-Kultur neu angeimpft werden. Wird die Kultur nicht neu angeimpft, kommt es zu einem Anstieg des pH-Werts, einem Absterben von Mycoplasma und zu einem Verringerung des Rekultivierungserfolgs.
9. Alle Testproben gelten als potentiell infektiös. Handhaben Sie potentiell kontaminiertes Material sicher entsprechend lokaler Bestimmungen.
10. Verwenden Sie die Reagenzien nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr.
11. Mischen Sie bei Gebrauch des vorliegenden Assays keine Komponenten von Kits mit unterschiedlichen Chargennummern.
12. Verwenden Sie keine trüben Fläschchen.
13. Verwenden Sie keine beschädigten Testplatten, mit verformten Näpfchen, offenen Trockenmittelbeuteln und beschädigter Aluminiumfolienversiegelung.
14. Die Leistungsfähigkeit des Tests ist nur bei Beachtung dieser Gebrauchsanleitung gewährleistet. Änderungen oder Abwandlungen in der Handhabung können das Ergebnis beeinflussen.
15. Da Mycoplasma eine hohe Affinität für Schleim-Zellmembranen hat, ist es wichtig so viel wie möglich Zellen beim Schleimhautabstrich zu gewinnen.
16. Gewinnen Sie die Probe vor der antibiotischen Behandlung.
17. Verwenden Sie eine standardisierte Technik, um eine Kontamination durch andere Mikroorganismen zu vermeiden.
18. Vor Ablauf einer 24-stündigen Inkubation, kann eine Probe nicht als negativ betrachtet werden.
19. Wenn der Titer der Probe gering ist, können die Näpfchen der Testplatte nicht die Farbe ändern oder der Farbwechsel ist inkonsistent.
20. Die Auswertung der Testplatte kann nur als Nachweis des Titers dienen. Der exakte Titer kann auf Agar bestimmt werden.
21. Die hinsichtlich der Probe eingesetzten Antibiotika, berücksichtigen nicht den Mycoplasma-Titer der Probe. Im Falle eines niedrigen Titers kann die wirkliche Empfindlichkeit eines Stammes von dem mit der Testplatte erlangten Ergebnis abweichen.
22. Ein Ergebnis, das bei der niedrigsten Konzentration von Antibiotika negativ und bei der höchsten Konzentration ist, ist als ungültig zu betrachten. In dieses Fall ist der Test zu wiederholen.

Lagerung

1. Lagern Sie sämtliche Komponenten bei 2-8°C.
2. Verwenden Sie die Testplatte nach dem Öffnen innerhalb von 8 Stunden.
3. Verwenden Sie das Kulturmedium nach dem Mischen von Verdünnungsmittel und Lyophilisat innerhalb von 72 Stunden.
4. Wird das beimpfte Medium nicht umgehend verwendet, dann lagern Sie das Medium für maximal 8 Stunden bei 18-28°C oder 48 Stunden bei 2-8°C.
5. Nach dem Öffnen kann das Mineralöl bis zum Ablaufen des aufgedruckten Verfallsdatums verwendet werden.
6. Transportieren Sie das Kit bei niedrigen Temperaturen und vermeiden Sie eine Exposition gegenüber Sonnenlicht. Transportieren Sie das Kit im Zeitraum Mai bis Oktober auf Eis.

Probenahme und -handhabung

1. Männliche Patienten: Führen Sie die Probenahme unter Verwendung eines Einweg-Auffangbehälters an Mittelstrahlurin oder unter Verwendung eines sterilen Probenahme-Tupfers an Harnröhrensekret (Prostatasekret oder Samen) durch.
2. Weibliche Patienten: Führen Sie die Probenahme unter Verwendung eines sterilen Probenahme-Tupfers an Zervikalsekret oder Vaginalsekret durch.
3. Verwenden Sie die Proben innerhalb von 4 Stunden für das Animpfen. Lagern Sie die Proben in Sonderfällen bei 2-8°C und impfen Sie innerhalb von 24 Stunden an.
4. Wenn die Probe mit einem UTM-Abstrichstäbchen gewonnen wurde, ist das UTM-Stäbchen bei Raumtemperatur (18-25°C) bis 24 Stunden zu lagern; bei längerer Aufbewahrung sollte es bei 2-8°C bis 48 Stunden gelagert werden.
5. Wenn die Probe zum Animpfen von Verdünnung dient (das angeimpfte Verdünnungsmittel kann als Transportmedium verwendet werden), ist die geimpfte Verdünnung bei Raumtemperatur (18-25°C) bis 24 zu lagern, bei längerer Aufbewahrung sollte die die geimpfte Verdünnung bei 2-8°C bis 48 Stunden gelagert werden.
   

Vorbereitung der Reagenzien

1. Erwärmen Sie alle Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur (18-25°C).
2. Stellen Sie den Inkubator auf 37°C ein.

Testdurchführung

1. Fügen Sie das Verdünnungsmittel vollständig zu dem Lyophilisat hinzu. Vortexen Sie den Ansatz, um das Pellet vollständig in Lösung zu bringen.
2. Impfen Sie das rekonstituierte Medium an. Verwenden Sie für das Animpfen den Probenahme-Tupfer, 400 μl ESwab-Probe, 500 μl Mittelstrahlurin-Probe, 0,05 ml Samenprobe oder beimpftes Medium. Lassen Sie diesen Arbeitsschritt aus, wenn vor dem Mischen von Verdünnungsmittel und Lyophilisat bereits ein Animpfen des Verdünnungsmittels erfolgt ist. Verschließend Sie das Fläschchen unter Verwendung des Deckels und schütteln Sie das Fläschchen, um den Inhalt vollständig zu mischen.
3. Pipettieren Sie 100 μl des beimpften Mediums in jeden Napf der Testplatte mit Ausnahme des C-Napfs (Kontrolle). Das Medium wird in insgesamt 29 Näpfe der Testplatte pipettiert. Klopfen Sie vorsichtig gegen die Testplatte, um die Beschichtung in Lösung zu bringen.
4. Geben Sie 1 Tropfen Mineralöl in jeden Napf.
5. Decken Sie die Testplatte ab. Inkubieren Sie die Testplatte für 24 Stunden bei 36-38°C.

Testergebnisse
Lesen Sie den Farbumschlag auf der Testplatte ab. Schlägt die Färbung von orange nach rot oder himbeerfarben um, zeigt dies Mycoplasma-Wachstum an. Tritt kein Farbumschlag auf, so zeigt dies Resultat entweder ein negatives Testergebnis oder eine Antibiotikaresistenz an. In seltenen Fällen verfärbt sich das Kulturmedium nach einer Inkubationsdauer von 24 Stunden hellrot (d. h., es tritt kein klar erkennbarer Farmumschlag auf). In diesem Fall wird empfohlen, die Kulturdauer um weitere 12-24 Stunden zu verlängern. (Mögliche Ursachen für einen nicht klar zu erkennenden Farbumschlag ist eine nur geringe Erregermenge in der Probe aufgrund von einer erst kurze Zeit zurückliegende Infektion des Patienten mit Mycoplasma, eine Probenahme in der Erholungsphase oder während einer Antibiotikabehandlung, oder die Inhibition von Mycoplasma durch Antibiotika.)
Hinweis: Als pathologischer Schwellenwert werden gewöhnlich für U. urealyticum angegeben: ≥10⁴ CCU/ml für eine Harnröhrenprobe, <10⁴ CCU/ml für eine Urinstrahl- oder Spermaprobe.
Das Vorhandensein vom M.hominis bei einem Schwellenwert von ≥10⁴ CCU/ml in einer endocervicalen Probe ist nicht normal.

Kontrollverfahren
Als Kontrollverfahren für den vorliegenden Assay wird die separate Verwendung kommerziell erhältlicher Referenzstämme empfohlen (UU (ATCC^® 27813) und MH (ATCC^® 15488)). Kultivieren Sie den Stamm ATCC^® 27813 in dem rekonstituierten Medium. Inkubieren Sie den Ansatz, bis sich das Kulturmedium hellrot verfärbt. Legen Sie anschließend eine Subkultur unter Verwendung eines zweiten Fläschchens mit rekonstituiertem Medium an und inkubieren Sie den Ansatz, bis sich das Kulturmedium hellrot verfärbt. Verdünnen Sie diese Kultur im Verhältnis 1:1000 unter Verwendung steriler Salzlösung und pipettieren Sie 100 µl dieses Gemischs zu einem frischen Fläschchen mit rekonstituiertem Medium hinzu. Beimpfen Sie eine Testplatte mit diesem letzten Kulturansatz. Das Resultat ist gültig, wenn in den Näpfen C+, UU, UU ≥ 104, THI (niedrige Konzentration) sowie CLA (niedrige Konzentration) ein Farbumschlag von orange nach rot oder himbeerfarben erfolgt. Testen Sie den Stamm ATCC^® 15488 entsprechend des oben beschriebenen Verfahrens. Das Resultat ist gültig, wenn in den Näpfen C+, MH, MH≥ 10⁴, ERY (niedrige und hohe Konzentration), AZI (niedrige und hohe Konzentration), THI (niedrige Konzentration), CLA (niedrige und hohe Konzentration) sowie ROX (niedrige und hohe Konzentration) ein Farbumschlag von orange nach rot oder himbeerfarben erfolgt.

Beschränkungen des Testverfahrens

1. Der vorliegende Assay soll als ein Hilfsmittel bei der klinischen Diagnose dienen. Verwenden Sie diesen Assay zusammen mit einer klinischen Untersuchung und unter Berücksichtigung der Krankengeschichte des Patienten sowie weiterer Testergebnisse.
2. Eine sehr geringe Anzahl alkalischer Proben kann zu einem direkten Farmumschlag des Kulturmediums führen. (Das Medium färbt sich umgehend rot). Der vorliegende Test basiert auf biochemischen Reaktionen, die einen pH-Anstieg in der Kultur und damit den Farbumschlag des rekonstituierten Mediums zur Folge haben.
3. Da die missbräuchliche klinische Verwendung von Antibiotika zum Auftreten einer geringen Anzahl antibiotikaresistenter Stämme führt, kann dies trotz der Anwendung verschiedener Antibiotika zur Inhibition nicht relevanter Bakterien in der Kulturbrühe eine sehr geringe Anzahl falsch positiver Resultate zur Folge haben. Wir empfehlen daher, die positiven Proben nach Möglichkeit unter Verwendung einer Mycoplasma-Agarplatte zu bestätigen.

Leistungsdaten

1. An Stämmen getestete Leistung
   Unter Verwendung von rekonstituiertem Medium wurden 16 reine Mycoplasma-Stämme in 3 Verdünnungen sowie 8 Mischungen von UU und MH in 2 Verdünnungen angeimpft und unabhängig von der Verdünnung als positiv  erkannt. Zusätzlich wurden 19 Interferenzstämme in dem 0.5 McFarland-Standard entsprechenden Urogenital-Proben mit jeweils 100 µl angeimpft. Die Ergebnisse waren negativ.
   Unter Verwendung der Testplatten wurden 12 reine Mycoplasma-Stämme in 3 Verdünnungen sowie 12 Mischungen von UU und MH in 2 Verdünnungen angeimpft und korrekt identifiziert. In dem rekonstituierten Medium wurden 18 reine Mycoplasma-Stämme kultiviert, bis ein Farbumschlag erfolgte. (Das Medium färbt sich hellrot.) Anschließend wurden die Kulturen bis zu einer finalen Konzentration von 104 CCU/ml verdünnt (CCU, Color Changing Units) und getestet. Die entsprechenden Näpfe UU≥104 oder MH≥104 verfärbten sich rot. 6 reine UU-Stämme wurden in 3 Verdünnungen 18 Mal getestet. Als Ergebnis trat ein Farbumschlag nach rot in den einzelnen Näpfen mit der nachfolgend beschriebenen Häufigkeit auf: ERY(niedrige Konzentration) - 1 Test; THI (niedrige Konzentration) - 3 Tests; THI (niedrige und hohe Konzentration) - 9 Tests; CLI (niedrige Konzentration) - 3 Tests; CLI (niedrige und hohe Konzentration) - 3 Tests; ROX (niedrige Konzentration) - 6 Tests; ROX (niedrige und hohe Konzentration) - 3 Tests; SPA (niedrige Konzentration) - 3 Tests. Die Färbung der Näpfe MIN, DOX, AZI, JOS, CLA, LEV, GAT (niedrige und hohe Konzentrationen) blieb in 18 Tests orange. 3 reine MH-Stämme wurden in 3 Verdünnungen 9 Mal getestet. Als Ergebnis trat ein Farbumschlag nach rot in den einzelnen Näpfen mit der nachfolgend beschriebenen Häufigkeit auf: ERY, AZI, CLA und ROX (niedrige und hohe Konzentration); THI (niedrige Konzentration) - 3 Tests; THI (niedrige und hohe Konzentration) - 3 Tests;  SPA (niedrige Konzentration) - 3 Tests; LEV - 1 Test. Die Färbung der Näpfe MIN, DOX, JOS, CLI und GAT blieb in 9 Tests orange.
   
2. Messgenauigkeit mittels Korrelation
   Im Rahmen einer Studie wurden Proben unter Verwendung des vorliegenden Assays sowie unter Verwendung des bioMérieux^®-Assays getestet. Die Daten wurden analysiert und in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst. 

Produkt	UU	MH	UU-MH	Gesamt
dieser Assay	58	11	17	86
bioMérieux	59	11	17	87

Die Anwendung der x2 -Methode ergab P >0,05. Es trat kein deutlicher Unterschied zwischen den beiden Methoden auf.

Literaturhinweise

1. Núñez-Calonge R, Caballero P, Redondo C, et al. Ureaplasma urealyticum reduces motility and induces membrane alterations in human spermatozoa. Hum. Reprod. 1998;13(1O):2756-2761.
2. Rylander M, Hallander HO. In vitro comparison of the activity of doxycycline, tetracycline, erythromycin and a new macrolide, CP 62993, against Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum. Scand J Infect Dis Suppl. 1988;53:12-17.
3. Murray P. Manual of clinical microbiology. 9th ed. Washington D.C.: ASM Press; 2007.
4. Streptococci by Means of Latex Agglutination,” Am J Obstet Gynecol, 1989, 160(3): 566-8.
   

Hersteller:

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akt. 09.11.2011