Produkte/Coagulation/Fibrinogen

FIBRINOGEN

ANALYSEMETHODE BASIEREND AUF DER THROMBIN-GERINNUNGSZEIT

Verpackung

REF.-NR. CG011 (mit Kalibrator und Kontrollen)
REF.-NR. CG009 (ohne Kalibrator und Kontrollen)
REF.-NR. CG010 (ohne Kalibrator und Kontrollen)
REF.-NR. ACF001 (Kit für ACF) 

5 x 2 ml
5 x 2 ml
10 x 2 ml
5 x 2 ml


Beschreibung und Testprinzipien

Das “Fibrinogen”-Kit basiert auf einer Methode, welche ursprünglich durch Clauss1 beschrieben wurde. 

Bei Vorliegen hoher Thrombin-Konzentrationen ist die zur Gerinnung erforderliche Zeit in verdünntem Plasma umgekehrt proportional zur Fibrinogen-Konzentration.

Das Verdünnen des Plasmas dient zur Verringerung interferierender Faktoren 3

 

Zusammensetzung und Inhalt der Reagenzien und Sicherheitshinweise

1. Bovines Thrombin 200 (REF.-NR. CG011, CG009, ACF001  5 x2 ml/ REF.-NR. CG010 10 x 2 ml)

Bovines Thrombin  ~ 100 NIH Units/ml
Tris-Puffer   
BSA Fraktion V                   
Natriumchlorid                     
Calciumchlorid                    
 0.8-1.2%
1.49%
0.9%
0.89%
0.144%

2. Imidazol-gepufferte Saline (IBS) pH 7.4 ± 0.2 (REF.-NR. CG011, CG009, CG010, ACF001 1 x 135  ml)

Imidazol
Natriumchlorid
Natriumcitrat
Salzsäure
Natriumazid

0.34%
0.6%
0.15%
0.14%
0.33%

3. Fibrinogen-Kalibrator* Nur REF.-NR. CG011 und NR. ACF001                        1 x 1 ml     
     Humanes Plasma, Probenahme mit Natriumcitrat                                               <0.1%

4. Kontroll-Plasma N* Nur REF.-NR. CG011 und NR. ACF001                             1 x 1 ml     
     Normales humanes Plasma, Probenahme mit Natriumcitrat                             <0.4%

5. Kontroll-Plasma A* Nur REF.-NR. CG011 und NR. ACF001                              1 x 1 ml
     Humanes Plasma, Probenahme und Einstellung mit Natriumcitrat                  <0.4%

Imidazol-gepufferte Saline ist als Xn = Schädlich eingestuft
INHALT: NATRIUMAZID

Gefährdung

 
. R22Schädlich bei Verschlucken
R52/53Schädlich für Wasserorganismen. Kann in Gewässern zu Langzeitschäden führen
. S60Material und Behälter müssen entsprechend gefährlichen Abfallstoffen entsorgt werden
. S61Vermeiden Sie eine Freisetzung. Siehe die speziellen Anweisungen/die Sicherheitsdatenblätter
S36/37Tragen Sie angemessene Schutzkleidung und Schutzhandschuhe

Lagerung und Stabilität der Reagenzien

Lagern Sie das Kit bei 2-8°C    
Die Reagenzien sind bis zum Erreichen der auf den Aufklebern aufgedruckten Verfallsdaten stabil.

 

Präparation und Stabilität der Arbeitslösungen

Bovines Thrombin:
Imidazol-gepufferte Saline:
Kalibrator:
Kontrol-Plasma N und A:

lyophilisiert
flüssig und gebrauchsfertig
lyophilisiert
lyophilisiert

Rekonstituieren Sie das Bovine Thrombin (jede Flasche) in 2 ml destilliertem Wasser.

Schwenken Sie die Flasche vorsichtig, bis der Inhalt vollständig gelöst ist.
Hinweis: Bei Verwendung photomechanischer Instrumente wird empfohlen, das Bovine Thrombin in 2 ml Kaolin zu rekonstituieren. Kaolin ist separat erhältlich, REF.-NR. CG008) 

Stabilität von rekonstituiertem Thrombin: bei 2-8°C 7 Tage, eingefroren 30 Tage6

Tauen Sie das Thrombin bei 37°C schnell auf. Frieren Sie es nicht wieder ein6 

Rekonstituieren Sie den Kalibrator und die Kontrollen (N and A) in 1 ml destilliertem Wasser

Schwenken Sie die Flasche vorsichtig, bis der Inhalt vollständig gelöst ist. Lassen Sie die Lösung vor der Verwendung anschließend für 15 Minuten ruhen. Das rekonstituierte Material ist bei 2-8°C 7-8 Stunden lang stabil.

Erwärmen Sie die Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur.


Probe

Frisch-Plasma mit 3.2% (0.109 M) Trinatriumcitrat


Probenahme und -lagerung

  1. Vermeiden Sie Hämolyse und Kontamination. Proben mit weniger als 90% des erwarteten Füllvolumens sollten verworfen werden (9 Anteile Blut und 1 Anteil 3,2% Trinatriumcitrat).
  2. Zentrifugieren Sie das Blut 15 Minuten bei 2500 x g. Analysieren Sie bei einer Lagerung der Proben bei 22-24°C den Überstand innerhalb von 2 Stunden. Für weitere Details zu Probenahme und -lagerung, siehe das NCCLS-Dokument H21-A32.


Vorsichtsmassnahmen

BIOLOGISCHES RISIKO *
Jede Komponente des bei der Präparation von Kalibrator und Kontrollen (A, N) verwendeten, ursprünglichen Materials ist unter Verwendung einer allgemein anerkannten Methode nicht-reaktiv auf HBsAg und negativ auf Antikörper gegen HCV und HIV 1/2 getestet worden.
Die zur Verfügung stehenden Testmethoden gewährleisten allerdings keine vollständige Sicherheit, dass durch aus humanem Material gewonnenen Produkte eine Übertragung von   Hepatitis, AIDS oder anderer infektiöser Krankheiten ausgeschlossen werden kann. Diese Produkte sollten daher entsprechend potentiell infektiösem biologischem Material behandelt werden.

 

 

Testablauf

Erstellen Sie Vorverdünnungen aus Proben und Kontrollen in einem Verhältnis von 1:10 in Imidazol-Puffer.
Pipettieren Sie die Vorverdünnungen in Küvetten.
Verdünnte Proben: 200 ml.
Erwärmen Sie jede Verdünnung 4-6 Minuten lang auf 37°C und fügen Sie 100 ml Bovines Thrombin (nicht vorwärmen) hinzu.
Bestimmen Sie die Gerinnungszeit.  


Ergebnisse

A. Bereiten Sie 4 verschiedene Verdünnungen des Kalibrators in IBS vor (1:5; 1:10; 1:15; 1:35)
Die 1:10-Verdünnung stellt 100% des zugewiesenen Werts dar. Der Verdünnungsfaktor zeigt das Verhältnis zwischen der 1:10-Verdünnung und den anderen Verdünnungen an.
B. Berechnen Sie den Mittelwert aus der Doppelbestimmung der Gerinnungszeit und erstellen Sie eine Log – Log-Kurve, in welcher die Fibrinogen-Konzentration gegen die Gerinnungszeit aufgetragen ist.

      Nur Beispiel:    

      Kalibrator = 304 mg/dl  Fibrinogen

VERDÜNNUNG

1:5
1:10
1:15
1:35

VERD.-FAKTOR

10/5 = 2
10/10 = 1
10/15 = 0.67
10/35 = 0.29

FIBRINOGEN (mg/dl)

304 x 2 = 608
304 x 1 = 304
304 x 0,67 = 204
304 x 0.29 = 88

MITTELWERT CT (Sek.)

6.6
12.3
18.6
24.2


C. Bestimmen Sie unter Verwendung der in der Kurve dargestellten Gerinnungszeit von Qualitätskontrolle und Patientenproben den entsprechenden Fibrinogen-Wert.


Erwartete Werte

Allgemein beträgt das normale Referenzintervall3: 

                                                 150-350 mg/dl

Dieser Wert dient ausschließlich als Richtlinie. 
Jedes Labor sollte einen eigenen normalen Referenzbereich etablieren.


Performanzeigenschaften

A. GENAUIGKEIT
Jeweils eine Plasma-Probe mit niedriger, normaler und hoher Fibrinogen-Konzentration wurde unter Verwendung von BGT-Reagenzien in mehreren Laboratorien getestet.

Die Ergebnisse wurden mit Werten verglichen, die unter Verwendung von Reagenzien anderer Hersteller in mehreren Laboratorien erhalten wurden9:

N

10
10
18

PROBE

Niedrig
Normal
Hoch   

BGT

144 mg/dl
294 mg/dl
488 mg/dl 

N

196
196
390 

ANDERE REAGENZIEN

163 mg/dl
297 mg/dl
474 mg/dl


B. PRÄZISIONJeweils eine Plasma-Probe mit niedriger, normaler und hoher Fibrinogen-Konzentration wurde unter Verwendung von BGT-Reagenzien an mehreren Tagen mit einem photooptischen Gerät getestet.  Zehn Standardkurven wurden an jedem Testtag bestimmt, mit einer Gesamtzahl von 30 Standardkurven. 

Der prozentuale CV wurde bestimmt wie nachfolgend angegeben:

                                                  5.9 %   für niedriges Plasma
                                                  3.4 %   für normales Plasma
 
                                                 2.9 %   für hohes Plasma



Beschränkungen

  1. Das Blut muss sofort zu dem Trinatriumcitrat-Antikoagulans hinzugefügt und vorsichtig mit diesem gemischt werden. (EDTA und Heparin sind als Antikoagulantien nicht geeignet.)
  2. Eine Hämolyse kann zu einer Aktivierung von Gerinnungsfaktoren führen sowie zu einer Interferenz bei der Bestimmung des Endpunkts. Ikterische und lipämische Proben können ebenfalls für Methoden zur Bestimmung des Endpunkts nicht geeignet sein.
  3. Die Probe sollte ausschließlich mit nicht benetzbaren Oberflächen in Kontakt kommen.
  4. Das Verhältnis von Blut zu Antikoagulans beträgt normalerweise 9:1. Dies resultiert in einer Citrat-Konzentration von 10.9 bis 12.9 mmol/l. Die genannte Konzentration muss für Patienten mit einem Hämatokrit-Wert oberhalb von  55% angepasst werden. Siehe NCCLS-Dokument H21-A32.
  5. Das Einfrieren und Auftauen von Plasma mit einem Restanteil von Blutzellen führt zu einer Schädigung von Zellmembranen. Dies kann die Ergebnisse beeinträchtigen.
  6. Akute inflammatorische Reaktionen können zu einer Erhöhung von zirkulierendem  Faktor I (Fibrinogen) führen.
  7. Ein hoher Anteil an Fibrinogen-Abbauprodukten, Fibrinogen  Degradation  Products (FDP), kann zu einer Erhöhung der Gerinnungszeit führen. Dies gilt vor allem bei einer Fibrinogen-Konzentration unterhalb von 150 mg/dl3.
  8. Bei Patienten mit qualitativen Fibrinogen-Abnormalitäten kann der Assay für die Thrombin-Gerinnungszeit eine verringerte Fibrinogen-Konzentration anzeigen. Bei Verwendung anderer Analysemethoden können für dieselben Proben die Ergebnisse bei einer quantitativen Bestimmung von Fibrinogen jedoch normal sein 3,4.
  9. Heparin interferiert nicht bei Einsatz therapeutisch wirksamer Dosen. Sehr hohe Heparin-Konzentrationen jedoch können zu niedrigen Ergebnissen bei einer Bestimmung von Fibrinogen führen. Das Enzym Batroxobin kann bei einer möglichen Heparin-Interfernz in diesem Assay als Ersatz für Thrombin verwendet werden.
  10. Hohe Konzentrationen an Paraprotein, Antikörpern gegen Thrombin und Substanzen, die aktivierend auf das fibrinolytische Systerm wirken, können mit Fibrinogen-Assays interferieren.
  11. Die Reagenzien für den Fibrinogen-Assay wurden für eine Verwendung bei 37°C entwickelt.  Stellen Sie sicher, dass alle Heizelemente ordnungsgemäß funktionieren.


QualitätskontrolleNormale und nicht normale Kontroll-Plasmas sollten zusammen mit Patienten-Plasmen getestet werden. Dieser Arbeitsvorgang wird zur Überwachung der Performanz der manuellen und automatisierten Prozesse des Assays empfohlen. Für die BGT-Kontrolle erhältliche Seren:

                    Kontroll-Plasma N REF.-NR. CG004
                   
Kontroll-Plasma A REF. NR. CG005

Bei Kontroll-Plasma N handelt es sich um nicht normales Plasma. Die Einstellung von Kontroll-Plasma A entspricht moderat defizientem Plasma.

Eine normale Kontrolle und mindestens eine nicht normale Kontrolle sollten täglich bei Initiierung der Testdurchführung und mindestens einmal pro Arbeitseinheit oder Assay-Gruppe analysiert werden. Kontrollen sollten ebenfalls bei jedem Wechsel von Reagenzien oder einer umfassenderen Justierung des Geräts getestet werden.   

 


Literatur

  1. Clauss A.: Acta Haemat 17, 237-246 (1957)  
  2. NCCLS: Collection, Transport and Processing of Blood Specimens  for Coagulation Testing
    and Performance of Coagulation Assays; 2nd edition Approved Guideline. NCCLS
    document H21-A3,  Wayne, PA. (1998)
  3. NCCLS: Procedure for determining fibrinogen in plasma. Approved Guideline. NCCLS
    document H30-A2. Wayne, PA, (2001)
  4. Musgrave K. A., Bick R. L,: Quality assurance in the Haemostasis Laboratory. In Bick R. L.
    et al, editors: Hematology: Clinical and Laboratory Practice Vol.2, 1309-1315, Mosby St.
    Louis MO (1993).

 



 
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