Keul-o-test

Clostridium Difficile Complete

KGST203
DIMDI Reg.-Nr.: DE/CA22/1116-134-IVD

Immunchromatographischer Schnelltest zum Nachweis von Clostridium difficile-Toxin A und -Toxin B in Fäkalproben

I- PRINZIP
Clostridium difficile ist eine der Hauptursachen antibiotikaassoziierter Diarrhöe oder pseudomembranöser Colitis (1). Bei dem Erreger handelt es sich um eines der am häufigsten nachgewiesenen Pathogene und eine wichtige Ursache nosokomialer Infektionen in Krankenhäusern und Pflegeheimen (2, 3).
Der genannte Organismus wurde aus diversen natürlichen Habitaten isoliert, einschließlich Böden, Heu, Sand, dem Kot verschiedener Großsäugetiere (Kühe, Esel und Pferde) sowie den Fäkalien von Hunden, Katzen, Nagern und Menschen (4). C. difficile produziert wenigstens drei potentielle Virulenz-faktoren. Es wird vermutet, dass Toxin A und Toxin B die wichtigste Rolle in der Pathogenese C.difficile-assoziierter Erkrankungen zukommt (5).
Bei Toxin A handelt es sich um ein Enterotoxin. Das Enterotoxin scheint mit dem Zytoskelett intestinaler Epithelzellen zu interferieren und somit die Funktionalität dieser Zellen zu zerstören. Toxin B stellt dagegen ein Zytotoxin dar, welches in der Gewebekultur in Zelllinien zu starken zytopathogenen Effekten führt (6).
Da nicht alle Stämme von C. difficile Toxine produzieren und ca. 2% der gesunden Erwachsenen sowie bis zu 50% der Kinder unterhalb von 2 Jahren eine Besiedelung mit C. difficile aufweisen können, ist ein Nachweis der Toxine (Toxin A und Toxin B) in den Stuhlproben von Patienten mit Diarrhöe aussagekräftiger als die Kultivierung der Bakterien.
Bei dem Keul-o-test Clostridium Difficile Complete handelt es sich um einen immunchromatographischen Lateral-Flow-Schnelltest zum qualitativen Nachweis von C. difficile-Toxin A und Toxin B in humanen Fäkalien.
Die Testvorrichtung besteht aus einem Kunststoffgehäuse mit zwei verschiedenen Teststäben für den Nachweis von C. difficile-Toxin A oder C. difficile-Toxin B. Ein gefärbter, an kolloidales Gold gekoppelter monoklonaler Antikörper gegen C. difficile-Toxin A oder C. difficile-Toxin B ist im linken Endbereich der Membran aufgebracht.
Nach erfolgter Probenahme unter Verwendung eines Röhrchens mit Extraktionslösung wird die Fäkalprobe aufgelöst und wenige Tropfen dieses Extrakts werden in jede Vertiefung  ( =>) der Reaktionseinheit gegeben.
Bei Durchfluss der Probe durch die Absorptionseinheit  bindet das markierte Antikörper-Farbstoff-Konjugat unter Ausbildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes an das Toxin A- oder Toxin B-Antigen (falls diese in der Probe vorliegen).
Dieser Komplex bindet an den polyklonalen anti-Toxin A- oder Toxin B-Antikörper in der positiven Reaktionszone und führt dort zur Ausbildung einer rosarot gefärbten Bande.
In Abwesenheit von Toxin A oder Toxin B erscheint keine Bande in der positiven Reaktionszone. Im weiteren Verlauf durchtritt die Reaktionsmischung die Kontrollzone der Absorptionseinheit. Nicht gebundenes Konjugat bindet an das Reagenz in der Kontrollzone und führt dort zur Ausbildung einer rosarot gefärbten Bande. Diese Bande zeigt an, dass die Reagenzien korrekt funktionieren.

II- KOMPONENTEN DES Keul-o-test Clostridium Difficile Complete KITS
Jedes Kit enthält sämtliche für die Durchführung der Tests erforderlichen Komponenten.

• Keul-o-test Clostridium Difficile Complete -Testvorrichtungen
• Plastikpipetten
• Plastikröhrchen, gefüllt mit 2 ml Extraktionslösung
• Probenapplikatoren
• Gebrauchsanleitung

III- LAGERUNG UND STABILITÄT

1. Sämtliche Komponenten des Keul-o-test Clostridium Difficile Complete -Kits sollten bei Raumtemperatur (zwischen +4°C und +30°C) in der versiegelten Folientasche gelagert werden.
2. Frieren Sie das Test-Kit nicht ein.
3. Das Keul-o-test Clostridium Difficile Complete -Kit ist bis zum Erreichen des auf dem Verpackungsetikett angegebenen Verfallsdatums stabil.

IV- VORSICHTSMASSNAHMEN

1. Der vorliegende Test wurde ausschließlich für den professionellen Gebrauch in der In vitro-Diagnostik entwickelt.
2. Lesen Sie vor der Durchführung des Tests sorgfältig die Gebrauchsanleitung.
3. Verwenden Sie den Test nicht nach Ablauf des auf dem Verpackungsetikett angegebenen Verfallsdatums.
4. Verwenden Sie keinen Test, dessen Schutzhülle beschädigt ist.
5. Sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben in Kontakt kommen, müssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder für mindestens eine Stunde bei 121°C autoklaviert werden.
6. Tragen Sie während der Probenanalyse Schutzkleidung wie beispielsweise einen Labormantel sowie Einweghandschuhe.
7. Essen, trinken oder rauchen Sie nicht in dem Bereich, der für die Handhabung der Proben und der Kit-Reagenzien vorgesehen ist.
8. Vermeiden Sie während der Probennahme und -analyse jeden Kontakt zwischen den Händen und den Augen oder der Nase.

V- PROBENAHME UND -VORBEREITUNG

1) Einleitung
Die Stuhlprobenahme sollte so bald wie möglich nach Einsetzen der Symptome erfolgen.
Verdünnte Proben können bei +2°C bis +8°C 3 Tage lang ohne Beeinträchtigung der Assay-Performanz gelagert werden.
Bewahren Sie unverdünnte Proben für eine Langzeitlagerung bei mindestens -20°C auf. Ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Proben wird nicht empfohlen und kann fehlerhafte Ergebnisse zur Folge haben. 

Achtung!
Verwenden Sie zur Probenahme keine Behälter, die Medium, Konservierungsstoffe, Seren tierischen Ursprungs  oder Detergenzien enthalten, da die genannten Substanzen mit dem Test interferieren können.

2) Durchführung

1. Kennzeichnen Sie das Plastikröhrchen, das die Extraktionslösung enthält, mit dem Namen oder der Kontrollnummer des Patienten.
2. Öffnen Sie das Röhrchen. Überführen Sie mit Hilfe des Probenapplikators eine Stuhlprobe in das Röhrchen:
   - Volumen bei festem Stuhl: eine erbsengroße Stuhlprobe.
   - Volumen bei flüssigem Stuhl: ein Stuhlprobe von 200 µl.
3. Verschließen Sie das Röhrchen fest mit dem Deckel. Mischen Sie Stuhlprobe und Verdünnungslösung durch gründliches Schütteln, bis sich die Probe aufgelöst hat.
4. Lassen Sie das Röhrchen eine ausreichend lange Zeit stehen, um ein Absinken großer Partikel auf den Röhrchenboden zu ermöglichen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen alternativ 1 Minute bei 500-1,000 RPM.

VI- TESTDURCHFÜHRUNG

1. Erwärmen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur.
2. Reißen Sie die Folientasche an der dafür vorgesehenen Trennnaht auf und entnehmen Sie die Testvorrichtung aus der Folientasche.
3. Öffnen Sie das Plastikröhrchen mit der extrahierten Probe.
4. Geben Sie mit Hilfe der Plastikpipette 6 Tropfen (200 µl) der extrahierten Lösung in jede der dafür vorgesehenen Vertiefungen (=>).
5. Lesen Sie die Testergebnisse 15 Minuten nach Zugabe der Probe zur Testvorrichtung ab. 

VII- ABLESEN DER TESTERGEBNISSE
MÖGLICHE ERGEBNISMUSTER

VIII - PERFORMANZMERKMALE

 1. C. difficile  TOXIN A

a) Analytische Sensitivität
Die Leistung des Tests wurde unter Verwendung eines Spektrums verdünnter Lösungen eines kommerziell erhältlichen Toxin A-Antigens geprüft. Der Test ermöglicht den Nachweis einer Konzentration von 4 ng/ml.

b) Diagnostische Sensitivität und Spezifität
An 63 Fäkalproben wurde unter Verwendung des Keul-o-test Clostridium Difficile A-Tests eine Vergleichsstudie mit Zytotoxizitäts- und Zellkulturmethoden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst:

Tabelle 1 : Evaluationsergebnisse

Sämtliche Proben zeigten unter Verwendung von Zytotoxizitäts- und Zellkulturmethoden identische Ergebnisse.
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, beträgt die Sensitivität des Keul-o-test Clostridium Difficile A -Tests im Vergleich mit der Zytotoxizitätsmethode 86.7% (13/15) und die Spezifität 91.7% (44/48).

c) Kreuzreaktion
Keul-o-test Clostridium Difficile A 1 zeigte bis zu 500 ng/ml Toxin B einheitlich negative Ergebnisse.

2. C. difficile TOXIN B

a) Analytische Sensitivität
Die Leistung des Tests wurde unter Verwendung eines Spektrums verdünnter Lösungen eines kommerziell erhältlichen Toxin B-Antigens geprüft. Unter diesen Bedingungen betrug die Nachweisgrenze des Tests 5 ng/ml.

b) Spezifität
Zur Bestimmung der Testspezifität wurde ein aufgereinigtes C. difficile-Toxin A-Antigen verwendet. Keul-o-test Clostridium Difficile B zeigte bis zu 500 ng/ml Toxin A einheitlich negative Ergebnisse.

IX- EINSCHRÄNKUNGEN 

1. Der Keul-o-test Clostridium Complete wurde speziell für Nachweis von Toxin A- oder Toxin B-Antigen in Stuhlproben entwickelt.
2. Wie bei jedem In vitro-Diagnoseverfahren sollte der Arzt die Testergebnisse mit Hilfe anderer klinischer Methoden bestätigen.
3. Ein negatives Ergebnis schließt eine Infektion mit C. difficile nicht generell aus. Ein solches Ergebnis kann durch eine proteolytische Verdauung der Toxine aufgrund unsachgemäßer Probenlagerung verursacht werden. Bei einem begründeten Verdacht auf Vorliegen einer Infektion sollte eine weitere Stuhlprobe untersucht werden.
4. Ein positives Ergebnis schließt das Vorliegen anderer Pathogene nicht aus.
5. Das Vorliegen signifikanter Mengen von Blut in den Fäkalproben kann in einer eingeschränkten Zahl der Fälle zu falsch positiven Ergebnissen führen.
6. Je nach dem Erscheinungsbild der Stuhlprobe kann sich die Färbung der Test- und Kontrolllinien geringfügig ändern. Bei der Analyse grünlicher oder schwärzlicher Stuhlproben wurden beispielsweise dunkelgrüne Banden (anstelle rosa-farbener Banden) beobachtet. Eine entsprechende Stuhlfärbung tritt bei einer Behandlung von Eisenmangel mit Eisenfumarat auf. Das Testergebnis sollte wie üblich interpretiert werden, d. h., zwei Banden sollten als ein positives Ergebnis und eine Bande sollte als ein negatives Ergebnis gewertet werden.

X- LITERARUR

1. Lierly, D,M, H.C. Krivan, and T.D. Wilkins. 1988. Clostridium difficile : its disease and toxins. Clin. Microbiol. Rev. 1:1-18.
2. Mulligan, M.E., L.R. Peterson, R.Y.Y. Kwok, C.R. Clabots, and D.N. Gerding. 1988. Immunoblots and plasmid fingerprints compared with serotyping and polyacrylamide gel electrophoresis for typing Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 26 : 41-31.
3. Gilligan, P.H., L.R. McCarthy, and V.M. Genta. 1981. Relative frequency of Clostridium difficile in patients with diarrheal disease. J. Clin. Microbiol. 14 : 26-31.
4. George, W.L. 1989. Antimicrobial agent-associated diarrhea and colitis, p661-678. In S.M. Finegold and W.L. George (ed.), Anaerobic infections in humans. Academic Press, Inc. New York.
5. Sullivan, N.M., Pellet S., and T.D. Wilkins. 1982. Purification and characterization of toxins A and B of Clostridium difficile. Infect. Immun. 35 : 1032-1040.
6. Lyerly, D.M., D.E. Lockwood, S.H. Richardson, and T.D. Wilkins. 1982. Biological activities of toxins A and B of Clostridium difficile. Infect. Immun. 35 : 1147-1150.

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